FastKing एक कदम RT-PCR किट

A-1 आरएनए अपमानित छ

Cont कुनै प्रदूषण संग उच्च गुणस्तर आरएनए शुद्ध। आरएनए गिरावट रोक्न को लागी सामग्री जस बाट आरएनए निकालीन्छ सकेसम्म ताजा हुनु पर्छ। आरटी प्रतिक्रिया अघि विकृत जेल मा शाही सेना अखण्डता विश्लेषण। आरएनए निकासी पछि, यो १००% formamide मा भण्डारण गरिनु पर्छ। यदि RNase अवरोधक प्रयोग गरीन्छ, तताउने तापमान <४५ डिग्री सेल्सियस, र पीएच .0.० भन्दा कम हुनुपर्छ, अन्यथा अवरोध गर्ने सबै बाध्य RNase जारी हुनेछ। यसबाहेक, RNase अवरोधक solutions ०.8 मिमी DTT युक्त समाधान मा थपिएको हुनुपर्छ।

A-2 आरएनए रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियाहरु को अवरोधकहरु छन्

EverReverse ट्रान्सक्रिप्शन अवरोधकहरु SDS, EDTA, ग्लिसरॉल, सोडियम pyrophosphate, spermidine, formamide, guanidine नुन, आदि नमूना संग नियन्त्रण आरएनए मिश्रण, र नियन्त्रण आरएनए प्रतिक्रिया संग उपज तुलना एक अवरोधक छ कि जाँच गर्न को लागी। 70% (v/v) इथेनॉल संग अवरोधकहरु लाई हटाउन को लागी आरएनए वर्षा को धो।

A-3 अपर्याप्त प्राइमर को annealing सीडीएनए को पहिलो स्ट्रान्ड synthesizing को लागी प्रयोग गरीन्छ

EtDermine कि annealing तापमान प्रयोग मा प्रयोग प्राइमरहरु को लागी उपयुक्त छ। अनियमित hexamers को लागी, यो 25 डिग्री सेल्सियस मा 10 मिनेट को लागी प्रतिक्रिया तापमान सम्म पुग्नु भन्दा पहिले तापमान राख्न को लागी सिफारिश गरीन्छ। जीन-विशिष्ट प्राइमरहरु (जीएसपी) को लागी, अन्य जीएसपी को कोशिश, वा ओलिगो (डीटी) वा अनियमित हेक्सामर स्विच।

A-4 आरएनए सुरु गर्ने सानो रकम

आरएनए को मात्रा बढाउनुहोस्। ५० एनजी भन्दा कम आरएनए नमूनाहरु को लागी ०.५ μg ०.५ μg एसिटाइल बीएसए पहिलो स्ट्रान्ड सीडीएनए संश्लेषण मा प्रयोग गर्न सकिन्छ।

A-5 लक्षित अनुक्रम विश्लेषण ऊतक मा व्यक्त छैन।

Other अन्य ऊतक प्रयास गर्नुहोस्।

A-6 पीसीआर प्रतिक्रिया असफल

Two दुई-चरण आरटी-पीसीआर को लागी, पीसीआर चरण मा सीडीएनए टेम्प्लेट प्रतिक्रिया भोल्युम को 1/5 भन्दा बढि हुन सक्दैन।

प्राइमर र टेम्प्लेट को A-1 गैर विशिष्ट एनीलिंग

-प्राइमर को 3'-अन्त 2-3 डीजी वा डीसी हुनु हुँदैन। जीन-विशिष्ट प्राइमरहरु को बजाय पहिलो कतरा संश्लेषण मा यादृच्छिक प्राइमर वा oligo (डीटी) को प्रयोग गर्नुहोस्। पहिलो केहि चक्र मा एक उच्च annealing तापमान को उपयोग गर्नुहोस्, र तब एक कम annealing तापमान। पीसीआर को लागी प्रतिक्रिया को विशिष्टता सुधार गर्न को लागी तातो शुरू Taq डीएनए पोलीमरेज को उपयोग गर्नुहोस्।

A-2 जीन विशिष्ट प्राइमरहरु को गरीब डिजाइन

Amp प्रवर्धन प्राइमर डिजाइन को लागी एउटै सिद्धान्तहरु को पालन गर्नुहोस्।

A-3 आरएनए जीनोमिक डीएनए संग दूषित

पीसीआर ग्रेड DNase I.Treat आरएनए को साथ डीएनए प्रदूषण पत्ता लगाउन रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन बिना एक नियन्त्रण प्रतिक्रिया सेटअप गर्नुहोस्।

A-4 प्राइमर dimer को गठन

3 'अन्त मा पूरक अनुक्रम बिना डिजाइन प्राइमरहरु।

A-5 धेरै उच्च Mg^२+ एकाग्रता

PtOptimize एमजी^२+ प्रत्येक टेम्पलेट र प्राइमर संयोजन को लागी एकाग्रता

A-6 विदेशी डीएनए संग दूषित

एरोसोल प्रतिरोधी सुझाव र UDG एंजाइमहरु को उपयोग गर्नुहोस्।

A-1 पहिलो कतरा उत्पादन को सामग्री धेरै उच्च छ

परम्परागत पीसीआर प्रतिक्रिया चरण मा पहिलो कतरा उत्पादन को मात्रा घटाउनुहोस्।

पीसीआर प्रतिक्रिया मा A-2 धेरै उच्च प्राइमर राशि

Pri प्राइमर इनपुट घटाउनुहोस्।

A-3 धेरै धेरै चक्रहरु

पीसीआर प्रतिक्रिया सर्तहरु अनुकूलन र पीसीआर चक्र संख्या घटाउनुहोस्।

A-4 धेरै कम annealing तापमान

-वृद्धि annealing तापमान गैर विशिष्ट दीक्षा र विस्तार रोक्न।

A-5 डीएनए DNase गिरावट द्वारा उत्पन्न oligonucleotide टुक्रा को गैर विशिष्ट प्रवर्धन-डीएनए प्रदूषण रोक्न उच्च गुणस्तर आरएनए निकाल्नुहोस्।

RT- पीसीआर सीडीएनए मा आरएनए प्रतिलिपि उल्टो गर्न को लागी छ, र तब लक्ष्य टुक्रा बढाउन पीसीआर प्रतिक्रिया को लागी एक टेम्पलेट को रूप मा उल्टो लिखित सीडीएनए को उपयोग गर्नुहोस्। या त यादृच्छिक प्राइमर, Oligo डीटी र जीन विशिष्ट प्राइमर प्रयोग को विशिष्ट शर्तहरु अनुसार छनौट गर्नुहोस्। सबै माथिका प्राइमरहरु कपाल काट्ने संरचना बिना छोटो यूकेरियोटिक सेल mRNA को लागी प्रयोग गर्न सकिन्छ।

अनियमित प्राइमर: कपाल काट्ने संरचना संगै लामो आरएनए को लागी उपयुक्त छ, साथै आरएनए को सबै प्रकार जस्तै आरआरएनए, mRNA, tRNA, आदि को रूप मा उनीहरु मुख्यतया एकल टेम्पलेट को आरटी पीसीआर प्रतिक्रिया को लागी प्रयोग गरीन्छ।

Oligo डीटी: PolyA tailing (prokaryotic आरएनए, eukaryotic Oligo डीटी rRNA र tRNA PolyA पुच्छर छैन) संग आरएनए को लागी उपयुक्त। Oligo डीटी PolyA पूंछ बाध्य छ किनभने, आरएनए नमूनाहरु को गुणस्तर उच्च हुन आवश्यक छ, र गिरावट को एक सानो मात्रा मा धेरै पूर्ण लम्बाई सीडीएनए संश्लेषण को मात्रा कम हुनेछ।

जीन-विशिष्ट प्राइमर: टेम्पलेट अनुक्रम को पूरक, परिस्थिति जहाँ लक्षित अनुक्रम ज्ञात छ को लागी उपयुक्त।

त्यहाँ दुई तरिकाहरु छन्:

१. आन्तरिक सन्दर्भ विधि: सिद्धान्त मा, सीडीएनए विभिन्न लम्बाइ को डीएनए टुक्रा हो, त्यसैले इलेक्ट्रोफोरोसिस को परिणाम धब्बा हो। यदि आरएनए बहुतायत कम छ, कुनै उत्पादन इलेक्ट्रोफोरोसिस मा देखाइनेछ, तर यसको मतलब यो छैन कुनै उत्पादन पीसीआर द्वारा प्रवर्धित गरिनेछ। सामान्य मा, आन्तरिक सन्दर्भ cDNA पत्ता लगाउन को लागी प्रयोग गर्न सकिन्छ। यदि आन्तरिक सन्दर्भ परिणाम छ, सीडीएनए को गुणवत्ता मूल रूप बाट ग्यारेन्टी गर्न सकिन्छ (केहि अवस्थामा, यदि लक्ष्य जीन टुक्रा धेरै लामो छ, त्यहाँ अपवाद हुन सक्छ)।

2. यदि यो टेम्पलेट द्वारा एक ज्ञात जीन प्रवर्धित छ, यो यो जीन को प्राइमरहरु द्वारा प्रमाणित गर्न सकिन्छ। आन्तरिक सन्दर्भ को प्रवर्धन जरूरी मतलब छैन कि त्यहाँ सीडीएनए संग कुनै समस्या छैन। आन्तरिक सन्दर्भ सीडीएनए मा उच्च बहुतायत छ, यो प्रवर्धन गर्न को लागी सजिलो छ। यदि सीडीएनए आंशिक रूप बाट विभिन्न कारणहरु को लागी क्षीण भएको छ, संभावना को परिप्रेक्ष्य बाट, कम प्रचुर मात्रामा लक्षित जीन को पीसीआर परिणाम धेरै प्रभावित हुनेछ। जबकि आन्तरिक सन्दर्भ अझै पनी बहुतायत मा उच्च छ, प्रवर्धन शायद प्रभावित हुने छैन।

आरएनए को आंशिक गिरावट। अखण्डता पत्ता लगाउनुहोस् र आरएनए को शुद्ध

विभिन्न प्रजातिहरु को आरएनए सामग्री फरक हुन सक्छ, तर सामान्य मा, निकालेको कुल आरएनए जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस मा दुई स्पष्ट २S एस र १S एस ब्यान्ड हुनु पर्छ, र पूर्व ब्यान्ड को चमक पछिल्लो को रूप मा दोब्बर उच्च हुनु पर्छ। 5S ब्यान्डले संकेत गर्दछ कि आरएनए अपमानित भएको छ, र यसको चमक गिरावट को डिग्री को आनुपातिक छ। आन्तरिक सन्दर्भ को सफल प्रवर्धन मतलब छैन कि आरएनए संग कुनै समस्या छैन, आन्तरिक सन्दर्भ उच्च बहुतायत मा छ, आरएनए तब सम्म प्रवर्धन गर्न सकिन्छ जब सम्म गिरावट गम्भीर छैन। OD₂₆₀/OD₂₈₀स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा मापन गरिएको शुद्ध आरएनए को अनुपात १.9 र २.१ को बीच हुनु पर्छ। आरएनए मा प्रोटीन अशुद्धता को एक सानो मात्रा अनुपात कम हुनेछ। जब सम्म मान धेरै कम छैन, RT प्रभावित हुने छैन। आरटी को लागी सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कुरा आरएनए अखंडता हो।

आन्तरिक सन्दर्भ जीन को विस्तार मात्र संकेत गर्न सक्छ कि आरटी सफल भएको छ, तर यो जरूरी सीडीएनए कतरा को गुणवत्ता संग सम्बन्धित छैन। आन्तरिक सन्दर्भ टुक्राहरु सामान्यतया आकार मा सानो र अभिव्यक्ति मा उच्च छन्, उनीहरु रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन मा सफल हुन को लागी सजिलो छ। जे होस्, लक्ष्य जीन को आकार र अभिव्यक्ति जीन बाट जीन फरक हुन्छ। सीडीएनए गुणस्तर मात्र आन्तरिक सन्दर्भ द्वारा विशेष गरी २ kb भन्दा लामो लक्ष्य टुक्रा को लागी न्याय गर्न सकिदैन।

केहि नमूनाहरु जटिल माध्यमिक संरचनाहरु, वा धनी जीसी सामग्री छ, वा कम बहुतायत संग कीमती छन्। यी अवस्थामा, उपयुक्त रिवर्स transcriptase लक्ष्य टुक्रा र नमूना को आकार अनुसार चयन गर्नुपर्छ। उच्च जीसी सामग्री र जटिल माध्यमिक संरचना संग आरएनए टेम्पलेट्स को लागी, यो कम तापमान मा माध्यमिक संरचना खोल्न गाह्रो छ, वा सामान्य उल्टो ट्रान्सक्रिप्टेस संग। यी टेम्पलेट्स को लागी, क्वान्ट रिवर्स ट्रान्सक्रिप्टेस को चयन गर्न सकिन्छ, किनकि यसको रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रदर्शन स्पष्ट रूप मा M-MLV श्रृंखला रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस को तुलना मा राम्रो छ, जो विभिन्न आरएनए टेम्प्लेटहरु लाई कुशलतापूर्वक प्रतिलिपि गर्न सक्छ र आरएनए लाई अधिकतम हदसम्म सीडीएनए पहिलो स्ट्रान्डमा ट्रान्सक्रिप्ट गर्न सक्छ। सामान्य रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस किट को उपयोग गर्दा, 20 μl प्रणाली मात्र प्रभावी ढंगले कुल आरएनए को 1 μg प्रतिलिपि रिवर्स गर्न सक्नुहुन्छ। कृपया किट को अधिकतम आरटी क्षमता ध्यान दिनुहोस्। यदि टेम्प्लेट अधिक मा जोडिएको छ, रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन उच्च बहुतायत संग आरएनए पक्षमा हुनेछ। तेसैले, यो राम्रो छ कि प्रणाली को अधिकतम क्षमता भन्दा बढी छैन।

A-1 निर्धारण गर्नुहोस् यदि आरएनए गम्भीर रूपमा अपमानित छ र यदि आरटी सफल छ

सामान्य मा, आन्तरिक सन्दर्भ प्रवर्धन को असफलताको कारण अक्सर गम्भीर आरएनए गिरावट को कारण हो। अर्को सम्भावित कारण उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन विफलता हो। आन्तरिक सन्दर्भ एक मानक को रूप मा सीडीएनए एकल स्ट्रान्ड को गुणवत्ता को न्याय गर्न को लागी प्रयोग गर्न सकिदैन, तर यो एक मानक को रूप मा प्रयोग गर्न सकिन्छ कि रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन सफल छ यदि आरएनए गुणस्तर को कुनै समस्या छैन। रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रक्रिया मा सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कुरा एक स्थिर तापमान र एक लगातार प्रतिक्रिया प्रणाली को क्रम मा प्रतिक्रिया दक्षता सुधार गर्न को लागी हो।

A-2 निर्धारित गर्नुहोस् कि आन्तरिक सन्दर्भ जीन प्रवर्धन को लागी प्राइमरहरु विश्वसनीय छन् र यदि पीसीआर मा प्रयोग अभिकर्मकहरु संग कुनै समस्या छ।

सापेक्ष मात्रा को लागी, आरएनए रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन, जो धेरै रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन किटहरु मा आवश्यक छ, जस्तै उदाहरण को लागी, 1 μg को रूप मा आरएनए इनपुट को मात्रा निर्धारित गर्नु पर्छ। चूंकि उल्टो ट्रान्सक्रिप्टेड सीडीएनए एक मिश्रित समाधान हो, आरएनए, ओलिगो डीटी, एन्जाइम, डीएनटीपी, र एक सानो डीएनए अवशेष सहित, विचलन को कारण हुनेछ, त्यसैले यो सही सीडीएनए मात्रा मा असंभव छ। तेसैले, आरएनए परिमाण आवश्यक छ। रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन दक्षता बिभिन्न नमूनाहरु को बीच मा समान छ, प्राप्त सीडीएनए को मात्रा उस्तै हुनु पर्छ, र मात्रात्मक विश्लेषण कुल आरएनए को एउटै मात्रा मा फरक जीन को अभिव्यक्ति स्तर को तुलना देखाउन सक्छ। जब सापेक्ष प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर प्रदर्शन, मात्रात्मक सीडीएनए रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन पछि आवश्यक नहुन सक्छ किनभने आन्तरिक सन्दर्भ जीन सन्दर्भ को रूप मा कार्य गर्न सकिन्छ।

यो मुख्यतया जीन संग सम्बन्धित छ, र लामो टुक्रा को रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन धेरै जीनहरु को लागी सम्भव छैन। सर्वप्रथम, रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन को दक्षता पीसीआर को तुलना मा धेरै कम छ। दोस्रो, जीसी धनी क्षेत्र र धेरै जीन को माध्यमिक संरचना दुबै रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन र पीसीआर प्रतिबन्धित। अन्तमा, पीसीआर को निष्ठा र प्रवर्धन दक्षता एकै समयमा ग्यारेन्टी गर्न गाह्रो छ। रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन को प्रक्रिया मा, कोहि पनि कम प्रतिलिपि जीनहरु को लागी लामो टुक्रा प्राप्त गर्न ग्यारेन्टी गर्न सक्दैन, विशेष गरी oligo डीटी को उपयोग गरेर। अधिक GC संग 5 'UTR को लागी, यो अझ गाह्रो छ। तेसैले, यो अझै पनी यादृच्छिक प्राइमरहरु संग ट्रान्सक्रिप्ट रिवर्स गर्न को लागी एक उचित तरीका हो, लक्ष्य टुक्रा मा प्राकृतिक दरार साइटहरु पाउन, खण्डहरु द्वारा प्रवर्धन, र त्यसपछि प्रतिबन्ध पाचन र ligation प्रदर्शन। सामान्य मा, यो सीधा २ kb भन्दा ठूलो टुक्राहरु लाई बढाउन गाह्रो छ, तर यो सधैं प्राप्त गर्न को लागी असम्भव छैन: १ सबै भन्दा पहिले, आरएनए/mRNA को अखण्डताको ग्यारेन्टी, र TRIZOL निकासी रुचाइएको छ। 2.M-MLV आरटी-पीसीआर किट सीधै प्रयोग गर्न सकिन्छ। समय annealing विस्तार र प्रवर्धन प्रक्रिया मा चक्र संख्या ठीक संग वृद्धि। वैकल्पिक रूपमा, नेस्टेड पीसीआर लागू गर्न सकिन्छ, वा सामान्य पीसीआर प्रवर्धन भन्दा पहिले उचित विस्तारित विकृतीकरण र विस्तार समय संग पहिले एक वा दुई प्रतिक्रियाहरु, जुन टुक्राहरु लाई विस्तार गर्न मद्दत गर्न सक्छ। पोलीमरेज को निष्ठा ध्यान दिनुहोस्। 3. लामो Taq पीसीआर मा आदर्श परिणाम प्राप्त गर्न को लागी प्रयोग गर्न सकिन्छ। 4. प्रोटीन अभिव्यक्ति आवेदन को लागी, उच्च निष्ठा पोलीमरेज लागू गरिनु पर्छ।

क्वान्ट/राजा RTase र TIANScript M-MLV: त्यहाँ रिवर्स transcriptase को दुई प्रकार TIANGEN द्वारा प्रस्ताव गरीएको छ। उनीहरु को बीच मुख्य अंतर टेम्पलेट्स को इनपुट राशि हो। क्वान्ट एक अद्वितीय रिवर्स ट्रान्सक्रिप्टेस हो, जुन सामान्यतया MLoney MURNE ल्यूकेमिया भाइरस बाट व्युत्पन्न M-MLV बाट फरक छ। Quant एक नयाँ उच्च दक्षता रिवर्स transcriptase recombinantly ईन्जिनियरि Es् Escherichia कोली द्वारा व्यक्त गरीएको छ। मात्रा उच्च रिवर्स transcriptional गतिविधि र उच्च उपज संग आरएनए को 50 एनजी -2 μg amplifying को लागी उपयुक्त छ। साधारण MMLV वा AMV संग तुलना, Quant को सबैभन्दा ठूलो विशेषता यो हो कि यो आरएनए टेम्पलेट्स संग धेरै बलियो आत्मीयता छ र उच्च तापमान विकृति बिना ट्रान्सक्रिप्ट जटिल टेम्प्लेट उल्टाउन सक्छ। उच्च जीसी सामग्री संग टेम्पलेट्स को लागी, रिवर्स दक्षता उच्च छ। जे होस्, यो रिवर्स ट्रान्सक्रिप्टेस RNase एच गतिविधि छ, जो सीडीएनए उत्पादन को लम्बाइ (<4.5 केबी टेम्पलेट्स को लागी उपयुक्त) लाई प्रभावित गर्न सक्छ। परम्परागत रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन को लागी, TIANScript MMLV रिवर्स ट्रान्सक्रिप्टेस सिफारिश गरीएको छ। यो RTase धेरै कमजोर RNase एच गतिविधि, जो लामो (> ५ केबी) सीडीएनए संश्लेषण को लागी उपयुक्त छ संग एक परिमार्जित एंजाइम हो।

एक कदम रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन र पीसीआर प्रवर्धन सीडीएनए संश्लेषण र प्रवर्धन, जो प्रदूषण कम गर्न को लागी उपयोगी छ को बीच ट्यूब कव खोल्न बिना नै ट्यूब मा पूरा गरीन्छ। चूंकि प्राप्त सबै सीडीएनए नमूनाहरु प्रवर्धन को लागी प्रयोग गरीन्छ, संवेदनशीलता उच्च छ, कुल आरएनए को ०.०१ pg को एक न्यूनतम संग। सफल एक कदम RTPCR को लागी, जीन विशिष्ट प्राइमरहरु सामान्यतया सीडीएनए संश्लेषण आरम्भ गर्न को लागी प्रयोग गरीन्छ। दुई-चरण विधि, अर्थात् रिवर्स ट्रान्सक्रिप्शन र पीसीआर प्रवर्धन दुई चरण मा गरिन्छ। पहिले उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन एक आरएनए टेम्प्लेट बाट सीडीएनए प्राप्त गर्न को लागी गरिन्छ, र प्राप्त सीडीएनए एक वा धेरै फरक पीसीआर प्रतिक्रियाहरु को अधीनमा छ। दुई चरण विधि oligo (डीटी) वा यादृच्छिक प्राइमरहरु सीडीएनए को पहिलो कतरा को संश्लेषण को मार्गदर्शन गर्न को उपयोग गर्न सक्नुहुन्छ, र एक विशिष्ट नमूना बाट सबै mRNA जानकारी ट्रान्सक्रिप्ट गर्न सक्नुहुन्छ।