Methylation- specipc पीसीआर (MSP) किट

A-1 टेम्पलेट

■ टेम्पलेट प्रोटीन अशुद्धता वा Taq अवरोधक, आदि समावेश गर्दछ DNAPnify डीएनए टेम्पलेट, प्रोटीन अशुद्धता हटाउन वा शुद्धिकरण किट संग टेम्पलेट डीएनए निकाल्नुहोस्।

Template टेम्पलेट को विकृति पूर्ण छैन rop उपयुक्त रूप बाट विकृति तापमान वृद्धि र विकृति समय लम्बाउने।

■ टेम्पलेट गिरावट the टेम्प्लेट पुन: तयार गर्नुहोस्।

A-2 प्राइमर

Pri प्राइमर को गरीब गुणस्तर eRimer- संश्लेषण प्राइमर।

■ प्राइमर गिरावट ——Aliquot संरक्षण को लागी सानो मात्रा मा उच्च एकाग्रता प्राइमर। धेरै चिसो र पग्लन वा दीर्घकालीन 4 डिग्री सेल्सियस cryopreserved बच्न।

Pri प्राइमर को अनुचित डिजाइन (जस्तै प्राइमर लम्बाई पर्याप्त छैन, प्राइमर, आदि को बीच गठन dimer) -पुन: डिजाइन प्राइमर (प्राइमर dimer र माध्यमिक संरचना को गठन बाट बच्न)

A-3 मिलीग्राम^२+एकाग्रता

■ मिलीग्राम^२+ एकाग्रता धेरै कम छ - राम्रो संग Mg बढाउनुहोस्^२+ एकाग्रता: एमजी अनुकूलन^२+ इष्टतम Mg निर्धारण गर्न 0.5 मिमी को एक अन्तराल संग 1 मिमी देखि 3 मिमी को प्रतिक्रियाहरु को एक श्रृंखला द्वारा एकाग्रता^२+ प्रत्येक टेम्पलेट र प्राइमर को लागी एकाग्रता।

A-4 एनीलिंग तापमान

■ उच्च annealing तापमान प्राइमर र टेम्पलेट को बाध्यता लाई प्रभावित गर्दछ। Ne annealing तापमान घटाउनुहोस् र २ डिग्री सेल्सियस को एक ढाल संग हालत अनुकूलन।

A-5 विस्तार समय

■ छोटो विस्तार समय extension विस्तार समय बढाउनुहोस्।

घटना: नकारात्मक नमूनाहरु पनि लक्षित अनुक्रम ब्यान्ड देखाउँछन्।

पीसीआर को A-1 प्रदूषण

Target लक्ष्य अनुक्रम वा प्रवर्धन उत्पादनहरु को क्रस प्रदूषण fully सावधानीपूर्वक नकारात्मक नमूना मा लक्षित अनुक्रम युक्त नमूना pipet वा तिनीहरूलाई अपकेंद्रित्र ट्यूब बाहिर फैलाउन। अभिकर्मक वा उपकरण विद्यमान न्यूक्लिक एसिड लाई समाप्त गर्न को लागी आटोक्लेभ हुनु पर्छ, र प्रदूषण को अस्तित्व नकारात्मक नियन्त्रण प्रयोगहरु को माध्यम बाट निर्धारित गरिनु पर्छ।

■ अभिकर्मक प्रदूषण liAliquot अभिकर्मक र कम तापमान मा स्टोर।

A-2 प्राइमr

■ मिलीग्राम^२+ एकाग्रता धेरै कम छ - राम्रो संग Mg बढाउनुहोस्^२+ एकाग्रता: एमजी अनुकूलन^२+ इष्टतम Mg निर्धारण गर्न 0.5 मिमी को एक अन्तराल संग 1 मिमी देखि 3 मिमी को प्रतिक्रियाहरु को एक श्रृंखला द्वारा एकाग्रता^२+ प्रत्येक टेम्पलेट र प्राइमर को लागी एकाग्रता।

■ अनुचित प्राइमर डिजाइन, र लक्ष्य अनुक्रम गैर लक्ष्य अनुक्रम संग समरूपता छ। E पुनः डिजाइन प्राइमरहरु।

घटना: पीसीआर प्रवर्धन ब्यान्ड अपेक्षित आकार संग असंगत छन्, या त ठूलो वा सानो, वा कहिले काहिँ दुबै विशिष्ट प्रवर्धन ब्यान्ड र गैर विशिष्ट प्रवर्धन ब्यान्ड हुन्छन्।

A-1 प्राइमर

Oor गरीब प्राइमर विशिष्टता

E पुनः डिजाइन प्राइमर।

■ प्राइमर एकाग्रता धेरै उच्च छ ro राम्रोसँग विकृति तापमान बढाउनुहोस् र विकृति समय लम्बाउनुहोस्।

A-2 मिलीग्राम^२+ एकाग्रता

Mg एमजी^२+ एकाग्रता धेरै उच्च छ - राम्रो संग Mg2+ एकाग्रता घटाउनुहोस्: Mg लाई अनुकूलित गर्नुहोस्^२+ इष्टतम Mg निर्धारण गर्न 0.5 मिमी को एक अन्तराल संग 1 मिमी देखि 3 मिमी को प्रतिक्रियाहरु को एक श्रृंखला द्वारा एकाग्रता^२+ प्रत्येक टेम्पलेट र प्राइमर को लागी एकाग्रता।

A-3 थर्मोस्टेबल पोलीमरेज

En अत्यधिक एन्जाइम मात्रा 0.5Reduce एन्जाइम मात्रा ०.५ यू को अन्तराल मा उचित।

A-4 एनीलिंग तापमान

■ annealing तापमान धेरै कम छ rop उपयुक्त annealing तापमान वृद्धि वा दुई-चरण annealing विधि अपनाउने

A-5 पीसीआर चक्र

Many धेरै धेरै पीसीआर चक्र PC पीसीआर चक्र को संख्या घटाउनुहोस्।

A-1 प्राइमरOor गरीब विशिष्टता —— प्राइमर पुनः डिजाइन, यसको विशिष्टता बृद्धि गर्न को लागी प्राइमर को स्थिति र लम्बाई परिवर्तन गर्नुहोस्; वा नेस्टेड पीसीआर प्रदर्शन गर्नुहोस्।

A-2 टेम्प्लेट डीएनए

Template टेम्प्लेट शुद्ध छैन the टेम्पलेट शुद्ध वा शुद्धीकरण किट संग डीएनए निकाल्नुहोस्।

A-3 मिलीग्राम^२+ एकाग्रता

—— एमजी^२+ एकाग्रता धेरै उच्च छ - राम्रो संग Mg घटाउनुहोस्^२+ एकाग्रता: एमजी अनुकूलन^२+ इष्टतम Mg निर्धारण गर्न 0.5 मिमी को एक अन्तराल संग 1 मिमी देखि 3 मिमी को प्रतिक्रियाहरु को एक श्रृंखला द्वारा एकाग्रता^२+ प्रत्येक टेम्पलेट र प्राइमर को लागी एकाग्रता।

A-4 dNTP

DDNTPs को एकाग्रता धेरै उच्च dDNTP को एकाग्रता उचित कम गर्नुहोस्

A-5 एनीलिंग तापमान

LowToo कम annealing तापमान rop उपयुक्त annealing तापमान वृद्धि

A-6 चक्र

ManyToo धेरै चक्र cycle अनुकूलन चक्र संख्या

पहिलो चरण उपयुक्त पोलिमरेज छान्नु हो। नियमित Taq पोलीमरेज़ 3'-5 'exonuclease गतिविधि को कमी को कारण प्रूफरीड गर्न सक्दैन, र बेमेल धेरै टुक्राहरु को विस्तार दक्षता कम हुनेछ। तसर्थ, नियमित Taq पोलीमरेज प्रभावी ढंगले ५ kb भन्दा ठूलो लक्ष्य टुक्रा बढाउन सक्दैन। विशेष परिमार्जन वा अन्य उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ संग Taq पोलीमरेज विस्तार दक्षता सुधार गर्न र लामो टुक्रा प्रवर्धन को आवश्यकताहरु लाई पूरा गर्न को लागी चयन गरीनु पर्छ। यसको अतिरिक्त, लामो टुक्राहरु को प्रवर्धन पनि प्राइमर डिजाइन, विकृति समय, विस्तार समय, बफर पीएच, आदि को समान समायोजन को आवश्यकता छ। सामान्यतया, १-2-२४ बीपी संग प्राइमर राम्रो उपज को लागी नेतृत्व गर्न सक्छ। आदेश टेम्प्लेट क्षति रोक्न को लागी, 4 ४ डिग्री सेल्सियस मा विकृति समय प्रति चक्र ३० सेकेन्ड वा कम गर्न को लागी, र प्रवर्धन भन्दा पहिले 4 ४ डिग्री सेल्सियस मा तापमान वृद्धि गर्न को लागी १ मिनेट भन्दा कम हुनु पर्छ। यसबाहेक, लगभग 68 डिग्री सेल्सियस मा विस्तार तापमान सेट र १ kb/मिनेट को दर अनुसार विस्तार समय डिजाइन लामो टुक्राहरु को प्रभावी प्रवर्धन सुनिश्चित गर्न सक्नुहुन्छ।

पीसीआर प्रवर्धन को त्रुटि दर उच्च निष्ठा संग विभिन्न डीएनए पोलीमेरेस को उपयोग गरेर कम गर्न सकिन्छ। सबै टाक डीएनए पोलीमेरेस मा अब सम्म पाईएको छ, Pfu एंजाइम सबैभन्दा कम त्रुटि दर र उच्चतम निष्ठा छ (संलग्न तालिका हेर्नुहोस्)। एन्जाइम चयन को अतिरिक्त, शोधकर्ताहरु लाई पीसीआर उत्परिवर्तन दर लाई अनुकूलन बफर संरचना, थर्मोस्टेबल पोलीमरेज को एकाग्रता र पीसीआर चक्र संख्या अनुकूलन सहित प्रतिक्रिया शर्तहरु लाई अनुकूलन गरेर कम गर्न सक्छ।