TIANSeq फंसे RNA-Seq किट (illumina)

वर्तमान मा, उच्च throughput अनुक्रमण टेक्नोलोजी मुख्य रूप देखि अर्को पुस्ता अनुक्रमण टेक्नोलोजी मा आधारित छ। अर्को पुस्ता अनुक्रमण टेक्नोलोजी को पठन लम्बाइ सीमित छ, हामी अनुक्रम को लागी सानो टुक्रा पुस्तकालयहरु मा पूर्ण लम्बाई अनुक्रम तोड्नु पर्छ। विभिन्न अनुक्रमण प्रयोगहरु को आवश्यकताहरु अनुसार, हामी सामान्यतया एकल समाप्त अनुक्रमण वा डबल समाप्त अनुक्रमण छनौट। वर्तमान मा अर्को पुस्ता अनुक्रमणिका पुस्तकालय को डीएनए टुक्राहरु सामान्यतया २००-800 बीपी को दायरा मा वितरित छन्।

क) डीएनए गुणस्तर मा गरीब छ र अवरोधकहरु छन्। एन्जाइम गतिविधि को निषेध बाट बच्न को लागी उच्च गुणस्तर को डीएनए नमूनाहरु को उपयोग गर्नुहोस्।

ख) डीएनए नमूना को मात्रा अपर्याप्त जब पीसीआर मुक्त विधि डीएनए पुस्तकालय निर्माण गर्न को लागी प्रयोग गरीन्छ। जब टुक्रा टुक्रा डीएनए को इनपुट ५० एनजी भन्दा बढि हुन्छ, पीसीआर मुक्त कार्यप्रवाह चुनिंदा पुस्तकालय निर्माण प्रक्रिया को दौरान बाहिर गर्न सकिन्छ। यदि पुस्तकालय को प्रतिलिपि संख्या सीधा अनुक्रम गर्न को लागी धेरै कम छ, डीएनए पुस्तकालय एडेप्टर ligation पछि पीसीआर द्वारा प्रवर्धित गर्न सकिन्छ।

ग) आरएनए प्रदूषणले गलत प्रारम्भिक डीएनए मात्रा प्रमाणन आरएनए प्रदूषण जीनोमिक डीएनए को शुद्धीकरण प्रक्रिया मा अवस्थित हुन सक्छ, जो गलत डीएनए मात्राकरण र पुस्तकालय निर्माण को दौरान अपर्याप्त डीएनए लोड गर्न को लागी नेतृत्व गर्न सक्छ। आरएनए RNase संग उपचार गरेर हटाउन सकिन्छ।

A-1

क) साना टुक्राहरु (b० bp-१२० bp) देखिन्छ साना टुक्राहरु सामान्यतया एडाप्टर टुक्राहरु वा एडेप्टरहरु द्वारा बनाईएको dimers हुन्। Agencourt AMPure XP चुम्बकीय मोती संग शुद्धिकरण प्रभावी ढंग बाट यी एडाप्टर टुक्राहरु लाई हटाउन र अनुक्रमण गुणवत्ता सुनिश्चित गर्न सक्नुहुन्छ।

ख) पीसीआर प्रवर्धन पछि पुस्तकालय मा ठूला टुक्राहरु देखा पर्छन् पुस्तकालय डीएनए टुक्रा को आकार एडाप्टर ligated पछि १२० बीपी द्वारा वृद्धि हुनेछ। यदि डीएनए टुक्रा एडाप्टर ligation पछि 120 bp भन्दा बढि बढ्छ, यो अत्यधिक पीसीआर प्रवर्धन को असामान्य टुक्रा प्रवर्धन को कारण हुन सक्छ। पीसीआर चक्र को संख्या घटाउन स्थिति लाई रोक्न सक्छ।

ग) पुस्तकालय डीएनए टुक्राहरु को एडाप्टर ligation पछि असामान्य आकार यो किट मा एडाप्टर को लम्बाई 60 bp हो। जब टुक्रा को दुई टाढा एडेप्टरहरु लाई ligated छन्, लम्बाई मात्र १२० बीपी द्वारा वृद्धि हुनेछ। जब यो किट द्वारा प्रदान गरीएको भन्दा अन्य एडाप्टर को उपयोग गर्नुहोस्, कृपया आपूर्तिकर्ता लाई सम्पर्क गर्नुहोस् जस्तै एडाप्टर लम्बाइ को रूप मा सान्दर्भिक जानकारी प्रदान गर्न को लागी। कृपया सुनिश्चित गर्नुहोस् कि प्रयोग कार्यप्रवाह र अपरेशन म्यानुअल मा वर्णित चरणहरु को पालन गर्नुहोस्।

घ) एडाप्टर ligation अघि असामान्य डीएनए टुक्रा आकार यो समस्या को लागी कारण डीएनए विखंडन को समयमा गलत प्रतिक्रिया शर्तहरु को कारण हुन सक्छ। फरक प्रतिक्रिया समय फरक डीएनए इनपुट को लागी प्रयोग गर्नु पर्छ। यदि डीएनए इनपुट १० एनजी भन्दा बढी छ भने, हामी १२ मिनेट को प्रतिक्रिया समय अनुकूलन को लागी शुरुवात समय को रूप मा छनौट गर्न को लागी सिफारिश गर्दछौं, र यस समयमा उत्पादन टुक्रा आकार मुख्य रूप मा ३००-५०० बीपी को दायरा मा छ। प्रयोगकर्ताहरु लाई आवश्यक आकार संग डीएनए टुक्राहरु लाई अनुकूलित गर्न को लागी आफ्नै आवश्यकताहरु अनुसार 2-4 मिनेट को लागी डीएनए टुक्राहरु को लम्बाइ बढाउन वा घटाउन सक्छ।

A-2

क) विखंडन समय अनुकूलित छैन यदि टुक्रा टुक्रा डीएनए धेरै सानो वा धेरै ठुलो छ, कृपया प्रतिक्रिया समय निर्धारण गर्न को लागी निर्देश मा प्रदान गरिएको विभाजन समय चयन को लागी दिशानिर्देशहरु लाई सन्दर्भ गर्नुहोस्, र एक नियन्त्रण को रूप मा यो समय बिन्दु को उपयोग, अतिरिक्त एक सेट अप प्रतिक्रिया प्रणाली लम्बाउन वा 3 मिनेट छोटो गर्न को लागी विखंडन समय मा अधिक सही समायोजन गर्न।

A-3

विखंडन उपचार पछि डीएनए को असामान्य आकार वितरण

क) विखंडन अभिकर्मक को गलत पग्लने विधि, वा अभिकर्मक पूर्ण रूपमा पग्लिए पछि मिश्रित छैन। बर्फ मा 5 × विखंडन एंजाइम मिक्स अभिकर्मक पिघलना। एक पटक thawed, बिस्तारै ट्यूब को तल flicking द्वारा समान रूपमा अभिकर्मक मिश्रण। अभिकर्मक भोर्केर नगर्नुहोस्!

ख) डीएनए इनपुट नमूना EDTA वा अन्य प्रदूषकहरु डीएनए शुद्धिकरण चरण मा नुन आयन र chelating एजेन्ट को कमी प्रयोग को सफलता को लागी विशेष गरी महत्वपूर्ण छ। यदि डीएनए १ × TE मा भंग गरीएको छ, विखंडन प्रदर्शन गर्न निर्देशन मा प्रदान विधि को उपयोग गर्नुहोस्। यदि समाधान मा EDTA एकाग्रता अनिश्चित छ, यो डीएनए को शुद्ध गर्न को लागी सिफारिश गरीन्छ र यसलाई बाद प्रतिक्रिया को लागी deionized पानी मा भंग।

ग) गलत प्रारम्भिक डीएनए परिमाणीकरण टुक्रा टुक्रा डीएनए को आकार डीएनए इनपुट को मात्रा संग निकटता संग सम्बन्धित छ। विखंडन उपचार भन्दा पहिले, क्यूबिट, पिकोग्रीन र अन्य विधिहरु को प्रयोग गरी डीएनए को सही मात्रा निर्धारण प्रतिक्रिया प्रणाली मा डीएनए को सही मात्रा निर्धारण गर्न आवश्यक छ।

 घ) प्रतिक्रिया प्रणाली को तयारी निर्देशन को पालन गर्दैन टुक्रिएको प्रतिक्रिया प्रणाली को तयारी बर्फ मा कडाईका साथ निर्देशन अनुसार गरिनु पर्छ। सबै भन्दा राम्रो प्रभाव सुनिश्चित गर्न को लागी, सबै प्रतिक्रिया घटक बर्फ मा राखीनु पर्छ र प्रतिक्रिया प्रणाली को तैयारी पूरा चिसो पछि बाहिर गरिनु पर्छ। तयारी पूरा भएपछि, कृपया फ्लिक वा pipet राम्रो तरिकाले मिश्रण गर्न को लागी। भोको नगर्नुहोस्!

१. अनुचित मिश्रण विधि (भंवर, हिंसक दोलन, आदि) पुस्तकालय टुक्राहरु को असामान्य वितरण को कारण बन्नेछ (निम्न चित्र मा देखाइएको छ), यस प्रकार पुस्तकालय को गुणस्तर लाई प्रभावित गर्दछ। तेसैले, जब विखंडन मिक्स प्रतिक्रिया समाधान तैयार, बिस्तारै पिपेट माथि र तल मिश्रण गर्न को लागी, वा झटका र समान रूप मा मिश्रण को औंला को टिप को उपयोग गर्नुहोस्। भँवर संग मिश्रण गर्न सावधान रहनुहोस्।

२. उच्च शुद्धता डीएनए लाइब्रेरी निर्माण को लागी प्रयोग गरिनु पर्छ

DNA राम्रो डीएनए अखण्डता: इलेक्ट्रोफोरोसिस ब्यान्ड ३० केबी भन्दा बढी छ, बिना टेली

■ OD260/230:> १.५

■ OD260/280: 1.7-1.9

३. डीएनए इनपुट मात्रा सही हुनु पर्छ यो Qubit र पिकोग्रीन विधिहरु को प्रयोग गर्न को लागी डीएनए को मात्रा, नानोड्रोप को तुलना मा सुझाव छ।

4. डीएनए समाधान मा EDTA को सामग्री EDTA विखण्डन प्रतिक्रिया मा एक ठूलो प्रभाव छ निर्धारण गर्नुपर्छ। यदि EDTA को सामग्री उच्च छ, डीएनए शुद्धीकरण पछि परीक्षण अघि प्रदर्शन गर्न को लागी आवश्यक छ।

५. विखंडन प्रतिक्रिया समाधान बरफ मा तयार हुनु पर्छ टुक्रा टुक्रा प्रक्रिया प्रतिक्रिया तापमान र समय (विशेष गरी बृद्धि जोडे पछि) को लागी संवेदनशील छ। क्रम मा प्रतिक्रिया समय को शुद्धता सुनिश्चित गर्न को लागी, बर्फ मा प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार गर्नुहोस्।

The. विखंडन प्रतिक्रिया समय सही हुनु पर्छ विखंडन कदम को प्रतिक्रिया समय सीधा टुक्रा उत्पादनहरु को आकार लाई प्रभावित गर्दछ, यस प्रकार पुस्तकालय मा डीएनए टुक्राहरु को आकार वितरण लाई प्रभावित गर्दछ।

१. यो किटमा कस्तो प्रकारको नमूना लागू हुन्छ?

यो किट को लागू नमूना प्रकार कुल आरएनए वा राम्रो आरएनए अखंडता संग mRNA शुद्ध हुन सक्छ। यदि कुल आरएनए पुस्तकालय को निर्माण को लागी प्रयोग गरीन्छ, यो rRNA हटाउने किट (बिल्ली#4992363/4992364/4992391) को उपयोग गर्न को लागी सिफारिश गरीएको छ पहिले rRNA लाई हटाउन।

२. FFPE नमूनाहरु यो किट संग पुस्तकालय निर्माण गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ?

FFPE नमूनाहरु मा mRNA सापेक्ष गरीब अखंडता संग एक निश्चित हद सम्म अपमानित गरिनेछ। पुस्तकालय निर्माण को लागी यो किट को उपयोग गर्दा, यो विखंडन समय अनुकूलन गर्न सिफारिश गरीन्छ (विखंडन समय छोटो वा टुक्रा प्रदर्शन छैन)।

३. उत्पादन म्यानुअल मा प्रदान गरिएको आकार चयन चरण को उपयोग गरेर, के सम्मिलित खण्ड हल्का विचलन देखाउन को लागी हुन सक्छ?

आकार चयन यस उत्पादन पुस्तिका मा आकार चयन चरण संग सख्त अनुसार गरिनेछ। यदि त्यहाँ विचलन छ, कारण हुन सक्छ कि चुम्बकीय मोती कोठा को तापमान संग सन्तुलित छैन वा पुरा तरिकाले मिश्रित छैन, पिपेट सही छैन वा तरल टिप मा रहन्छ। यो प्रयोग को लागी कम सोखना संग सुझावहरु को उपयोग गर्न को लागी सिफारिश गरीएको छ।

4. पुस्तकालय निर्माण मा एडेप्टर को चयन

पुस्तकालय निर्माण किट एडाप्टर अभिकर्मक समावेश गर्दैन, र यो TIANSeq एकल सूचकांक एडाप्टर (Illumina) (4992641/4992642/4992378) सँगै यो किट को उपयोग गर्न को लागी सिफारिश गरीएको छ।

५. पुस्तकालय को QC

पुस्तकालय मात्रात्मक पहिचान: Qubit र qPCR क्रमशः पुस्तकालय को जन एकाग्रता र दाढ़ एकाग्रता निर्धारण गर्न को लागी प्रयोग गरीन्छ। अपरेशन कडाईका साथ उत्पादन पुस्तिका अनुसार छ। पुस्तकालय को एकाग्रता सामान्यतया NGS अनुक्रमण को आवश्यकताहरु लाई पूरा गर्नेछ। पुस्तकालय वितरण दायरा को पत्ता लगाउने: Agilent २१०० Bioanalyzer को उपयोग गरी पुस्तकालय वितरण दायरा पत्ता लगाउन।

6. प्रवर्धन चक्र संख्या को चयन

निर्देशन अनुसार पीसीआर चक्र को संख्या -12-१२ छ, र पीसीआर चक्र को संख्या आवश्यक नमूना इनपुट अनुसार चयन गर्नुपर्छ। उच्च उपज पुस्तकालयहरु मा, प्रवर्धन मा सामान्यतया फरक डिग्री मा हुन्छ, जो Agilent २१०० Bioanalyzer को पत्ता लगाउने मा लक्षित दायरा को शिखर पछि एक सानो ठूलो शिखर द्वारा प्रकट हुन्छ, वा Qubit को पत्ता लगाईएको एकाग्रता qPCR को तुलना मा कम छ। हल्का प्रवर्धन मा एक सामान्य घटना हो, जो पुस्तकालय अनुक्रमण र पछि डाटा विश्लेषण लाई प्रभावित गर्दैन।

7. स्पाइक्स Agilent २१०० Bioanalyzer को पत्ता लगाउने प्रोफाइल मा देखिन्छ

Agilent २१०० Bioanalyzer पत्ता लगाउने मा स्पाइक्स को उपस्थिति नमूनाहरु को असमान विखंडन को कारण हो, जहाँ निश्चित आकार मा अधिक टुक्राहरु हुनेछ, र यो पीसीआर संवर्धन पछि अधिक स्पष्ट हुनेछ। यस अवस्थामा, यो आकार चयन प्रदर्शन नगर्न सुझाव दिईन्छ, अर्थात टुक्रा वितरण सानो र ध्यान केन्द्रित छ, जहाँ १५ मिनेट इन्क्यूबेटेड को लागी 4 ४ डिग्री सेल्सियस को टुक्रा शर्त सेट, र एकरूपता सुधार गर्न सकिन्छ।